傳染病病原快速鑒定與溯源新技術(shù)的探索與挑戰(zhàn)

目錄

• 1、闞飆：CDC細(xì)菌性傳染病監(jiān)側(cè)需要什么樣的介子介型技術(shù)

• 2、夏勝利：腸道傳染病病原快速鑒定與溯源技術(shù)探索

• 3、楊瑞馥：高通量核酸側(cè)序技術(shù)在應(yīng)對(duì)新發(fā)、突發(fā)傳染病中的作用

• 4、扈慶華：食源性疾病的快速診斷和溯源

【精彩發(fā)言】

1、闞飆：CDC細(xì)菌性傳染病監(jiān)側(cè)需要什么樣的介子介型技術(shù)

我們探討的傳染病暴發(fā)，實(shí)際上包含了幾個(gè)不同的形式：第一種是一段短時(shí)間內(nèi)在局限的地區(qū)出現(xiàn)了很多相似的病例，這個(gè)就叫暴發(fā)了，這是暴發(fā)的一種形式。但是現(xiàn)在面臨一個(gè)問(wèn)題：有時(shí)也有一些暴發(fā)，病例是出現(xiàn)在不同的地方，各地看起來(lái)像單個(gè)病例，但實(shí)際是暴發(fā)病例分散開(kāi)了，尤其是早期，所以，如何發(fā)現(xiàn)暴發(fā)，是當(dāng)前面臨的重要問(wèn)題。對(duì)于傳染病監(jiān)測(cè)，我們流行病學(xué)調(diào)查了很多信息，實(shí)驗(yàn)室里也檢測(cè)到很多的信息，還有臨床上的信息。這些匯總起來(lái)，最后形成病例的個(gè)案信息，來(lái)幫助我們進(jìn)行判斷，尋找暴發(fā)以及溯源的蛛絲馬跡。

目前我們使用的傳染病網(wǎng)絡(luò)直報(bào)系統(tǒng)，是要通過(guò)監(jiān)測(cè)來(lái)發(fā)現(xiàn)暴發(fā)和溯源，對(duì)于流行病學(xué)人員，要發(fā)現(xiàn)暴發(fā)，而且能夠找到原因，找到引起暴發(fā)的問(wèn)題，然后切斷擴(kuò)散途徑，那就控制了。對(duì)于微生物學(xué)人員，主要工作包括檢測(cè)，需要認(rèn)識(shí)病原是什么，并通過(guò)病原學(xué)證據(jù)敏感提示可能的暴發(fā)，并回溯到源頭。

對(duì)于傳染病檢測(cè)中的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)已經(jīng)不能忽略了。在傳染病口常監(jiān)測(cè)和疫情調(diào)查當(dāng)中，我們會(huì)得到菌株，然后進(jìn)行分子分型，再放到分型數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查找比對(duì)，形成報(bào)告，提示可能的問(wèn)題，同時(shí)再開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查分析。實(shí)驗(yàn)室里通過(guò)對(duì)菌株分子分型發(fā)現(xiàn)成簇型別的菌株，由此提出是否有暴發(fā)的問(wèn)題，隨后啟動(dòng)流行病學(xué)調(diào)查分析，一起來(lái)確認(rèn)暴發(fā)，并采取行動(dòng)，這個(gè)是實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)中通過(guò)分子分型來(lái)發(fā)現(xiàn)暴發(fā)做檢測(cè)的途徑。用這些病原體分子分型技術(shù)，是從病原學(xué)的角度切人來(lái)尋找問(wèn)題，包括提示與確定暴發(fā)、發(fā)現(xiàn)傳播鏈、尋找傳染來(lái)源，以及包括擴(kuò)散到什么范圍等內(nèi)容。這里給大家展示一個(gè)視頻(視頻略)，是當(dāng)時(shí)的美國(guó)副總統(tǒng)戈?duì)柕囊欢沃v述病原菌分子分型用于暴發(fā)發(fā)現(xiàn)和調(diào)查的視頻。另外有一個(gè)例子，通過(guò)利用菌株的分子分型技術(shù)來(lái)做傳染病的監(jiān)測(cè)，把分散在美國(guó)、日本的散發(fā)痢疾病例菌株進(jìn)行分析，通過(guò)圖譜相同的現(xiàn)象來(lái)提示有共同問(wèn)題，隨后通過(guò)流行病學(xué)的調(diào)查在夏威夷找到了源頭，能夠顯示出，分散的病例實(shí)際上是暴發(fā)病例。

要用這個(gè)分析方法，就是基于病原體分子分型的傳染病監(jiān)測(cè)，根據(jù)共同感染來(lái)源的菌株是相同的這一現(xiàn)象和依據(jù)，幫助我們從病原學(xué)的角度來(lái)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，尋找引起暴發(fā)的因素。這些病人分散到不同地區(qū)，我們一般不去關(guān)注感染源到底來(lái)自哪個(gè)地方，因?yàn)楸砻嫔峡词巧l(fā)病例，而口常監(jiān)測(cè)中我們沒(méi)有時(shí)間、沒(méi)有精力來(lái)對(duì)每個(gè)病例做流行病學(xué)調(diào)查。

剛才提到的例子，對(duì)于我們是比較常見(jiàn)的疾病，沒(méi)有流行病學(xué)人員喜歡去做腹瀉病的流調(diào)，因?yàn)樘胀?，也產(chǎn)生不了什么影響力，但是這恰恰是一類(lèi)考驗(yàn)流行病學(xué)人是不是真正具有很深厚的流行病學(xué)調(diào)查能力的考題。對(duì)于如何病例定義，我舉個(gè)例子，對(duì)于腹瀉的調(diào)查，一般是將具有拉肚子癥狀的病人作為病例，然后再找對(duì)照。畢竟腹瀉太常見(jiàn)，我們限定一下病例的定義，確定是哪個(gè)地方哪段時(shí)間的腹瀉病例，成為調(diào)查的病例。又因?yàn)楦篂a有病毒感染、細(xì)菌感染，有嘔吐、發(fā)熱等，癥狀也略有差異，為更精確將我們要找的那種因素導(dǎo)致的腹瀉病例納人真正病例組，我們又加一點(diǎn)關(guān)于時(shí)間的內(nèi)容，比如近兩周某個(gè)地方的腹瀉伴發(fā)熱的病例。再明確一點(diǎn)，比如近兩周某某縣的鼠傷寒沙門(mén)菌感染病例。這實(shí)際上依然是籠統(tǒng)的，因?yàn)槟硞€(gè)地區(qū)的具有定義癥狀的、并有鼠傷寒沙門(mén)菌引起的病例仍較多，且會(huì)由不同因素引起。既然一個(gè)暴發(fā)是由共同一個(gè)原因、一個(gè)病原引起，此時(shí)我們加上這個(gè)菌株的分子分型信息，將病例組病例定義為近幾周某某縣具有JPXXO1B0865PFGE帶型的鼠傷寒沙門(mén)菌感染病例，這樣排除了由其他感染來(lái)源導(dǎo)致的具有相似癥狀的病例，將病例組病例盡可能局限為一個(gè)共同因素、相同菌株引起的腹瀉病例，這樣突出了危險(xiǎn)因素的OR值，能促進(jìn)感染因素的發(fā)現(xiàn)。這是針對(duì)暴發(fā)調(diào)查和溯源的層面來(lái)做病例定義。

這有一個(gè)很具體的例子，是美國(guó)的一起腹瀉暴發(fā)調(diào)查，這個(gè)圖(圖略)想突出的是從9月6口一直到1月24口。這當(dāng)中大概有600多個(gè)鼠傷寒沙門(mén)菌感染病例。實(shí)際上，美國(guó)全年大概有實(shí)驗(yàn)室分離到鼠傷寒沙門(mén)菌的病原確診感染病例6000例，半年也得有3000例，為什么這3000例病例當(dāng)中的2400例不去調(diào)查，只是調(diào)查這600多例?就是因?yàn)椴±x中加了分子分型，感染了具有這種圖譜的鼠傷寒沙門(mén)菌的病例才劃為病例組，其他的2400例感染者的鼠傷寒沙門(mén)菌菌株，因不是這個(gè)型，就暫時(shí)不做調(diào)查了，因?yàn)檫@些人可能感染了不同的鼠傷寒沙門(mén)菌，感染的因素不是要調(diào)查的。為什么這個(gè)調(diào)查費(fèi)了這么多時(shí)間?是因?yàn)橛昧诉@個(gè)定義來(lái)確定病例組以后，雖病例組病例菌株都具有這個(gè)帶型了，進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)這個(gè)人吃了這個(gè)食品、那個(gè)人吃了那個(gè)食品。與以前的暴發(fā)調(diào)查不一樣，發(fā)現(xiàn)這些病例的可能食品不一樣。最終調(diào)查答案是由美洲花生公司供應(yīng)的花生醬給食品加工廠，食品加工廠拿了污染的花生醬加工成各種產(chǎn)品，然后再供應(yīng)給消費(fèi)者，最后形成這么大范圍的暴發(fā)，而且這些病例是感染了相同或非常相似圖譜的菌株，但來(lái)源食品不一樣。而食品不一樣也只是表象，實(shí)際上這些不同食品有個(gè)共同污染來(lái)源，是用作原材料的污染花生醬。

這個(gè)例子中就是從病原特征人手來(lái)做暴發(fā)調(diào)查，顯示分離菌株分子分型在暴發(fā)發(fā)現(xiàn)和溯源調(diào)查中的重要作用?；氐轿覀兊闹黝}，我們要什么樣的分子分型，而且是CDC需要的?現(xiàn)在有很多的表型分型方法，分子分型方法也有很多，我們要什么樣的?要求分辨力強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易于標(biāo)準(zhǔn)化、做一次實(shí)驗(yàn)便宜，而且要快速。另外，不依賴(lài)病原分離的方法更好，也是為了提高分析速度，盡快發(fā)現(xiàn)菌型問(wèn)題和開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查。

當(dāng)然這幾條當(dāng)中，簡(jiǎn)便就是好操作、重復(fù)性好就是穩(wěn)定。一些方法今天做是這樣的結(jié)果，明天做是那樣的結(jié)果，就沒(méi)有辦法用。易于標(biāo)準(zhǔn)化就是為了重復(fù)穩(wěn)定，易于質(zhì)控。還要便宜，只有便宜了才適于大批量操作。所以，總體的目標(biāo)就是大家會(huì)使用的而且是穩(wěn)定的方法。

我們需要一個(gè)分辨力強(qiáng)的分子分型方法，到底要強(qiáng)到什么程度?是不是一個(gè)菌株一個(gè)型、恨不得把一個(gè)微小的變異都描述出來(lái)?作為基因組的研究者來(lái)說(shuō)，我們當(dāng)然希望發(fā)現(xiàn)其中的任何差異，但是在流行病學(xué)應(yīng)用上，我們要強(qiáng)調(diào)到什么分型程度。有時(shí)候太細(xì)了菌株稍有變化即被分成不同型，而暴發(fā)菌株引起暴發(fā)過(guò)程中，傳給不同個(gè)體，會(huì)發(fā)生微小變化，因此分辨能力太強(qiáng)了，可能會(huì)造成不必要的麻煩，一個(gè)共同來(lái)源的暴發(fā)菌株也被分成不同的型。分辨能力多少為合適?古語(yǔ)一段話，“東家之子，增之一分則太長(zhǎng)，減之一分則太短，著粉則太白，施朱則太赤”，講的就是恰到好處。我們到底需要什么樣的分辨能力的方法?理想的就是能夠?qū)⒐餐瑏?lái)源的菌株聚成簇，并有別于其他不同來(lái)源的菌株；當(dāng)然前提是共同來(lái)源的菌株在暴發(fā)傳播過(guò)程中基因組不變。現(xiàn)實(shí)中有這樣的問(wèn)題，菌株復(fù)制過(guò)程中基因組是要變的，但在一定時(shí)間內(nèi)，不變或變化有限。所以，我們?cè)诹餍胁W(xué)上調(diào)查，就希望能夠找到分子分型方法不受小程度變異影響，或者是這個(gè)方法最好能夠容許微小隨機(jī)的變異。今天上午我們討論的一個(gè)問(wèn)題就是，不同菌株分析出的序列有變化，則關(guān)鍵是這幾個(gè)菌株到底是不是一樣的。這個(gè)永遠(yuǎn)是繞圈的問(wèn)題，對(duì)于一個(gè)具體的暴發(fā)傳播，我們不知道細(xì)菌怎么變。

理論上，我們希望用一個(gè)分型方法，將暴發(fā)的菌株聚到一塊，將另外一個(gè)源頭來(lái)的不一樣菌株被分開(kāi)。

有時(shí)候分辨力強(qiáng)也有一個(gè)問(wèn)題，一個(gè)病人的標(biāo)本有時(shí)可分到具有多種型別的一種菌株。例如海地霍亂的一次調(diào)查，他們也用MLVA方法，對(duì)病人采集糞便標(biāo)本以后，標(biāo)本不增菌，直接去做平板單菌落培養(yǎng)，挑不同單菌落進(jìn)行分析?？唇Y(jié)果，對(duì)于1號(hào)病人來(lái)看，菌株都是MLVA型別，4號(hào)病例的20個(gè)單菌落里有4個(gè)是MLVA的A型，7個(gè)C型，4個(gè)D型，4個(gè)H型，可見(jiàn)用MLVA從一個(gè)病人的標(biāo)本中將不同菌落分成了多個(gè)型，那么到底這個(gè)病人感染了什么型的菌株?如果只挑一個(gè)菌落，將4號(hào)病人菌株分成了不同型，就可能認(rèn)為這個(gè)病例感染了不同來(lái)源的菌株，會(huì)把流調(diào)人員的目標(biāo)引到別的地方去。所以分型太細(xì)了也不行。

另外是要求快速，為什么要快速?無(wú)非是暴發(fā)應(yīng)急的需求，要求盡快發(fā)現(xiàn)源頭，快速十預(yù)，減少病例。并且病例調(diào)查時(shí)，盡早確定病例并開(kāi)展調(diào)查，能獲得更準(zhǔn)確的信息。感染后從發(fā)病、分離、確認(rèn)到分析是需要時(shí)間的，分子分型需要時(shí)間，時(shí)間如果太長(zhǎng)，比如用了2周，可能感染危險(xiǎn)因素已經(jīng)沒(méi)有了，再也回溯不了。而且，2周以后再去找這個(gè)病例，詢(xún)問(wèn)15天之前到20天之前吃了什么，確實(shí)是回答不了或回答很不準(zhǔn)確。傳染病報(bào)告網(wǎng)絡(luò)做了以后，做出了較多的很好的溯源調(diào)查例子，但是目前看來(lái)激動(dòng)人心的例子還主要是污染因素持續(xù)存在數(shù)周或數(shù)月，分析后再開(kāi)展調(diào)查時(shí)，污染因素還在，這個(gè)時(shí)候能找到來(lái)源。

我們要求分型方法最好是非病原分離依賴(lài)的，就是針對(duì)標(biāo)本、不分離菌株即可針對(duì)其中的病原進(jìn)行分子分型，最主要的也是為了快速分型這一點(diǎn)，所以需求還是快速、靈敏。核酸檢測(cè)新方法測(cè)序技術(shù)等，可能會(huì)幫助我們來(lái)做快速分型。這個(gè)做起來(lái)很困難，大家提出來(lái)一些方法，無(wú)非還是要求分辨力強(qiáng)、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易于標(biāo)準(zhǔn)化、便宜、快速。問(wèn)題就在于哪些方法是好的。現(xiàn)在有很多的大規(guī)模測(cè)序，將整個(gè)標(biāo)本的核酸序列全測(cè)出，要解決的問(wèn)題是，如果我們從原始標(biāo)本中直接測(cè)序，要知道擴(kuò)增的片段是不是致病菌的，哪些是致病菌的，從樣本中大規(guī)模測(cè)序，怎么拼接片段，哪些片段是標(biāo)本中正常細(xì)菌的，哪些片段是致病菌的。即便測(cè)序價(jià)格便宜了，如何讓序列拼接分析在網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室方便開(kāi)展?這個(gè)結(jié)果能不能在不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比較?所以，現(xiàn)有的技術(shù)可能能夠解決一些問(wèn)題，實(shí)踐中目前還是存在一些困難要克服。

關(guān)于分子分型方法的評(píng)價(jià)問(wèn)題。一個(gè)重要的基礎(chǔ)方面是菌株選擇。一定要選擇流行病學(xué)不相關(guān)的菌株、暴發(fā)的菌株分別進(jìn)行方法評(píng)價(jià)，并要求樣本量?，F(xiàn)在很多微生物學(xué)家缺乏流行病學(xué)的思維，描述一個(gè)全球流行的變異的時(shí)候，只有少量菌株就完成分析了。這里面缺乏了實(shí)際流行菌株的代表性，如果研究中樣本選擇的量和隨機(jī)性不夠，很多東西就被忽略了。

還有分型方法的參數(shù)比較與優(yōu)化，以及與其他方法的比較評(píng)價(jià)。再一個(gè)是選擇的分子分型方法能不能進(jìn)行很好的質(zhì)量控制，以及實(shí)驗(yàn)室之間的比較問(wèn)題。最近發(fā)布的副溶血弧菌分子分型的標(biāo)準(zhǔn)化方法，是經(jīng)過(guò)不同國(guó)家的實(shí)驗(yàn)室參與評(píng)價(jià)才發(fā)布出去，因此每一種分子分型方法都需要經(jīng)過(guò)不同實(shí)驗(yàn)室、不同菌株的大量評(píng)價(jià)。

關(guān)于圖譜比較問(wèn)題，有時(shí)候我們使用相似度的百分比數(shù)值描述帶型相似的不同程度。如相似度86% ，97%，那么到底大于86%算一致還是大于97 %算一致?我們?cè)谧鑫⑸飳W(xué)分析的時(shí)候，這些數(shù)據(jù)能夠幫助我們進(jìn)行相對(duì)定量的分析，但是CDC不用這些數(shù)據(jù)，不設(shè)定判別界值。還要注意流行病學(xué)分析時(shí)不要求進(jìn)化信息。在PulseNet中數(shù)據(jù)的比較，不是說(shuō)把1萬(wàn)個(gè)帶型放在一個(gè)數(shù)據(jù)集里面比較，這樣計(jì)算量極大。而是把待分析菌株的帶型與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有所有帶型兩兩比較，這樣普通計(jì)算機(jī)也不會(huì)死機(jī)，目的是能否找到具有相同或非常相似帶型的那些菌株。所以CDC需要的技術(shù)和分析，與遺傳學(xué)分析、基因組分析還是有差別的。

基因組學(xué)家醉心于發(fā)現(xiàn)差別，流行病學(xué)家需要容許一些差別。當(dāng)然這里面有一個(gè)問(wèn)題，我們總想把所有的問(wèn)題解決得完美，這在流行病學(xué)中是不可能的。我們是解決主要問(wèn)題，不是解決100%的問(wèn)題。我們做的各種分析的檢測(cè)，確實(shí)需要新技術(shù)、快速的技術(shù)、靈敏的技術(shù)，也不能太靈敏，也需要非經(jīng)過(guò)病原培養(yǎng)的分子分型技術(shù)，這些都是擺在我們面前的挑戰(zhàn)。但截止到目前，我們還是需要盡可能多的菌株，然后盡快地進(jìn)行分子分型。

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2、夏勝利：腸道傳染病病原快速鑒定與溯源技術(shù)探索

大家上午好!很高興能夠在這個(gè)平臺(tái)上與大家交流。這次我主要是結(jié)合河南省的實(shí)際工作來(lái)探索腸道傳染病病原快速鑒定與溯源技術(shù)的應(yīng)用前景。

一、當(dāng)前傳染病疫情的現(xiàn)狀

根據(jù)河南省近年來(lái)的疫情狀況并結(jié)合國(guó)內(nèi)疫情情況分析，當(dāng)前傳染病疫情，首先是新舊傳染病縱橫交錯(cuò)。從20世紀(jì)80年代，我國(guó)的傳染病是穩(wěn)中有降，原因是疫苗和抗生素的廣泛應(yīng)用。但是進(jìn)人21世紀(jì)以后，新發(fā)再發(fā)傳染病再次流行，結(jié)核、鼠疫、霍亂等古老傳染病復(fù)蘇，艾滋病、埃博拉出血熱、瘋牛病、軍團(tuán)病、萊姆病等50余種新發(fā)傳染性疾病開(kāi)始流行。因此，目前傳染病仍是人類(lèi)的主要死因，目前的局面給傳染病的預(yù)防控制工作帶來(lái)了新的壓力。

其次是外界環(huán)境的改變對(duì)細(xì)菌和病毒的影響。濫伐森林、土地流失、人口流動(dòng)、城市擁擠、對(duì)野生動(dòng)物的肆意捕殺等人類(lèi)短視行為，迫使細(xì)菌和病毒因?yàn)樯娴膲毫Πl(fā)生基因變異，原來(lái)不致病的病原體變異為可致病，使得疾病預(yù)防控制工作越來(lái)越艱巨。

三是濫用抗生素與抗藥性菌株的流行。新舊傳染病在今天流行的原因是多方面的。目前，耐藥菌迅速增加，曾經(jīng)很容易用抗生素治愈的一些疾病已無(wú)濟(jì)于事，這均由抗生素使用管理不嚴(yán)所致。美國(guó)傳染病專(zhuān)家休斯博士說(shuō)，"一旦病菌產(chǎn)生了抗藥性，那么我們就徹底回到了抗生素發(fā)現(xiàn)之前的年代”。

再者，濫用生物武器。美國(guó)發(fā)生“911”恐怖事件，郵件使人感染炭疽病的事例，甚至SARS的傳聞等。如何防范以危害人群健康為目標(biāo)的生物恐怖突發(fā)事件，已成為世人矚目的焦點(diǎn)問(wèn)題。

二、流行趨勢(shì)一樣很?chē)?yán)峻

(1)流行范圍廣、流行無(wú)疆界。這個(gè)與我們現(xiàn)代化的進(jìn)程是分不開(kāi)的。隨著國(guó)際貿(mào)易和旅游的發(fā)展，人口流動(dòng)導(dǎo)致傳染病迅速擴(kuò)散。艾滋病已遍布全球190多個(gè)國(guó)家。萊姆病、軍團(tuán)病、消化性潰瘍、腎綜合征出血熱等其他20種疾病全球分布，另外，全球氣候變暖導(dǎo)致熱帶地區(qū)的媒介傳染病在亞熱帶地區(qū)出現(xiàn)。

(2)傳染性強(qiáng)、傳播速度快。一些疾病能通過(guò)飛沫傳播(馬爾堡出血熱、傳染性非典型肺炎等);一些則通過(guò)氣溶膠感染(拉薩熱、腎綜合征出血熱、漢坦病毒肺綜合征等);還有的則通過(guò)密切接觸傳播(埃博拉出血熱、艾滋病等);0139霍亂則通過(guò)水，EHEC 0104    EHEC O157通過(guò)食物傳播引起暴發(fā)流行。

(3)與動(dòng)物關(guān)系密切。隨著人類(lèi)行為的改變、社會(huì)的改變，動(dòng)物源性疾病越來(lái)越凸顯;馬爾堡出血熱、拉薩熱、EHEC、萊姆病、禽流感等20種疾病與動(dòng)物有關(guān)。

(4)病死率高、危害大。艾滋病已導(dǎo)致1300多萬(wàn)人死亡，埃博拉出血熱、漢坦病毒肺綜合征、軍團(tuán)病、禽流感等多種疾病的病死率很高。各種新傳染病帶來(lái)沉重的醫(yī)療費(fèi)用負(fù)擔(dān)，也造成巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失。

三、傳染病檢測(cè)、鑒定及溯源技術(shù)

傳統(tǒng)的鑒定技術(shù)在基層用得比較多，例如鏡檢、培養(yǎng)和生化鑒定等。就細(xì)菌學(xué)鑒定方面，生化是認(rèn)祖歸宗很重要的方法;另外，血清玻片凝集、乳膠凝集、噬菌體分型、試管凝集、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等也是很有效的病原微生物鑒定技術(shù)。

景懷琦教授言簡(jiǎn)意賅地強(qiáng)調(diào)了生物資源的重要性。關(guān)鍵是如何拿到，如何采集到合格的標(biāo)本。目前在基層很多經(jīng)典的、傳統(tǒng)的方法被慢慢邊緣化了，越來(lái)越不被人們重視，再加上一些客觀原因，比如老一代技術(shù)人員退休，新一代跟不上來(lái)，很多過(guò)去能做的現(xiàn)在都開(kāi)展不了。生物資源的發(fā)現(xiàn)、采集、保存、共享均需要一系列的機(jī)構(gòu)甚至政策做保障。這次沙龍上所展示的很多新技術(shù)如何能夠跟實(shí)際工作相結(jié)合，將是非常大的挑戰(zhàn)。

目前基因擴(kuò)增等快速篩查檢測(cè)方法，用于細(xì)菌的并不很多，應(yīng)用最多、最成功的是在病毒的快速檢測(cè)上，包括多重PC R、基因芯片還有其他的分析技術(shù)。這些技術(shù)要在基層應(yīng)用，還有一段的路要走，技術(shù)推廣和降低成本是關(guān)鍵。盡管我們有快速篩查的方法，最后還是要分離到真正的病原菌。

為了能夠有效提高現(xiàn)場(chǎng)檢出率，我設(shè)計(jì)了腸道病原菌快速鑒定的流程圖，應(yīng)用該流程可從一份糞便標(biāo)本中快速檢測(cè)8個(gè)主要腸道致病菌屬。其中的增菌培養(yǎng)、專(zhuān)用顯色培養(yǎng)基、KIA ， MIU和氧化酶篩查試驗(yàn)，可有效甄別數(shù)十種不同菌屬。專(zhuān)用顯色培養(yǎng)基將是未來(lái)的一個(gè)方向，易于基層推廣?，F(xiàn)場(chǎng)快速生化鑒定方面RapIDONE系統(tǒng)非常實(shí)用，4個(gè)小時(shí)內(nèi)出結(jié)果，簡(jiǎn)單快捷。另外，我們?cè)O(shè)計(jì)的對(duì)常見(jiàn)的腹瀉病毒的檢驗(yàn)流程也非常實(shí)用，從前期采樣到病毒的篩查，到后期對(duì)5個(gè)腹瀉病毒的基因分型，很高效。利用這個(gè)框架，一旦出現(xiàn)疫情，走這個(gè)通道能夠迅速地對(duì)傳染病做出診斷。

楊瑞馥教授昨天強(qiáng)調(diào)，在新技術(shù)應(yīng)用方面應(yīng)遵照“表型為主、基因?yàn)檩o”的路線，我認(rèn)為非常貼切。事實(shí)上，新基因發(fā)現(xiàn)的資源很多，目前缺少的就是可操作性強(qiáng)的機(jī)制和平臺(tái)。微生物的表型是很容易得到，比如生長(zhǎng)特性、營(yíng)養(yǎng)條件、菌落形態(tài)、生化反應(yīng)和血清學(xué)變化等，對(duì)于基層簡(jiǎn)單而實(shí)用，能夠解決實(shí)際問(wèn)題。比如說(shuō)我們發(fā)現(xiàn)了志賀菌福氏4c( Fxv變種)，發(fā)現(xiàn)了福氏1d，還發(fā)現(xiàn)了福氏6(福氏Z變種)等新菌型，并在世界上首次以中國(guó)的菌種命名志賀菌，就是用傳統(tǒng)鑒定方法體系得到的。后期通過(guò)基因組測(cè)序，又從基因?qū)用嫔献C實(shí)了形成表型的基因變化，加快了人們對(duì)新菌型的認(rèn)識(shí)和命名。這并不代表基因組測(cè)序方法更先進(jìn)，或是傳統(tǒng)方法落后了，只是從不同層面去觀察一個(gè)事物。還有如耐藥表型也很重要。我在丹麥做研究時(shí)，僅根據(jù)我們分離的沙門(mén)菌株耐藥基因表型差別，發(fā)現(xiàn)了新的qnrD耐藥基因，并在Gene bank注冊(cè)。事實(shí)上發(fā)現(xiàn)新的東西并不困難，關(guān)鍵是要從眾多積累的信息中尋找到正在變化的表型，從中發(fā)現(xiàn)新的基因突變。

傳染病調(diào)查中，及時(shí)發(fā)現(xiàn)暴發(fā)、溯源和分析擴(kuò)散趨勢(shì)，會(huì)有效促進(jìn)防控策略的制定，并使措施更具有針對(duì)性，目前我們用得最多的溯源方法是PFGE      PFGE之所以在世界各地備受關(guān)注有它固有的原因，它是目前分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，能夠針對(duì)整條染色體分型，敏感、特異，重復(fù)性好，且分辨率高。分型結(jié)果的積累可迅速生成一個(gè)資源數(shù)據(jù)庫(kù)，如果該資源庫(kù)能夠?qū)崿F(xiàn)全球共享，那么它所發(fā)揮的作用將無(wú)可替代。利用該資源庫(kù)，我們可迅速對(duì)比分析出病原菌的種類(lèi)和來(lái)源，可迅速做到控制傳染源和切斷傳播途徑，保護(hù)人群遠(yuǎn)離疾病。

另外，我們做了MLST ，MLSV方面部分病原菌對(duì)比分析工作?；谛蛄袦y(cè)定技術(shù)的MLVA在病原微生物的分子分型和暴發(fā)溯源方面有廣泛的應(yīng)用前景，其方法更加靈敏、簡(jiǎn)便、快捷和準(zhǔn)確，人為誤差小，對(duì)軟硬件要求低，更易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和推廣普及。目前該技術(shù)為中國(guó)CDC " PulseNet”網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用的第二代分子分型技術(shù)。

眾所周知，世界乃至宇宙每天都在變化，世間一切事物時(shí)刻都在變異，而我們所面對(duì)的微生物世界同樣在隨著世界和時(shí)間的變化，迫于免疫和藥物等生存的壓力，也在不斷選擇變化以求得生存。所以，進(jìn)人21世紀(jì)，有50余種新發(fā)、再發(fā)傳染病再次流行。因此，加強(qiáng)疾病監(jiān)測(cè)仍是疾控中心今后的工作重點(diǎn)，只有監(jiān)測(cè)到位才可以實(shí)現(xiàn)對(duì)疫情的預(yù)警，各種前沿的溯源技術(shù)才能迅速跟進(jìn)，增強(qiáng)我們對(duì)疫情的動(dòng)態(tài)管理。一旦出現(xiàn)暴發(fā)苗頭，可以快速溯源，快速制定相關(guān)政策和控制措施，實(shí)現(xiàn)人類(lèi)對(duì)疾病預(yù)防控制的終極目的。

四、檢測(cè)、鑒定和溯源技術(shù)評(píng)價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)化

我相信大家所有的努力和技術(shù)的建立都是為疫情現(xiàn)場(chǎng)和疾病控制服務(wù)的，關(guān)鍵是如何轉(zhuǎn)化成果，技術(shù)方法如何標(biāo)準(zhǔn)化?，F(xiàn)在有很多公司研發(fā)了很多有用的方法，包括我們自己也有一些方法。問(wèn)題在于如何評(píng)價(jià)它們的價(jià)值，評(píng)價(jià)它們的適用性，將來(lái)如何規(guī)范推廣，推廣以后如何再完善，等等，我們國(guó)家巫須這樣一個(gè)監(jiān)管機(jī)制。并且我相信，以建立此機(jī)制為契機(jī)，將會(huì)有很多的新發(fā)現(xiàn)和豐厚的回報(bào)。

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3、楊瑞馥：高通量核酸側(cè)序技術(shù)在應(yīng)對(duì)新發(fā)、突發(fā)傳染病中的作用

測(cè)序技術(shù)給我們帶來(lái)兩大進(jìn)步。一個(gè)是我們認(rèn)識(shí)到生命是序列的，而且這個(gè)序列可以轉(zhuǎn)化為數(shù)字，所以可以用計(jì)算機(jī)來(lái)計(jì)算生命。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，從過(guò)去的通量非常低、價(jià)格非常高的手工測(cè)序，發(fā)展到現(xiàn)在的高通量、價(jià)格非常低的新一代測(cè)序技術(shù)，所以我們現(xiàn)在有能力去大量測(cè)定人的基因組，測(cè)了以后我們會(huì)做以前不敢做的事情。目前在市場(chǎng)上比較流行的三種新一代高通量測(cè)序技術(shù)，現(xiàn)在已發(fā)展到第三代測(cè)序技術(shù)，此處不再贅述其原理。

高通量核酸測(cè)序技術(shù)發(fā)展這么快，我們可以在短期內(nèi)快速獲得大量序列。在這種大的背景下，微生物學(xué)如何去做呢?在面對(duì)新發(fā)、突發(fā)傳染病的情況下，我們要研究疾病是怎么引起的，就是快速準(zhǔn)確鑒定的問(wèn)題。再一個(gè)是如何有效治療，要了解致病特征和治療藥物的選擇。同時(shí)，獲得了這些信息以后，巫須考慮的是如何控制傳染病，就是需要準(zhǔn)確溯源，只有找到源頭在哪里，才可以對(duì)傳染病進(jìn)行有效的控制。

這三個(gè)重要的問(wèn)題都可以通過(guò)高通量測(cè)序來(lái)回答。這里舉一個(gè)例子：2011年德國(guó)大腸桿菌0104： H4暴發(fā)，從最原始的暴發(fā)到處置結(jié)束，大概三個(gè)月的時(shí)間。在這種情況下，在5月28口收到了德國(guó)寄來(lái)的DNA標(biāo)本后，我們與深圳華大基因研究院一起，首先用第三代測(cè)序技術(shù)于6月2口獲得了原始數(shù)據(jù)，這個(gè)原始數(shù)據(jù)直接公布到網(wǎng)上。利用這些數(shù)據(jù)，我們和英國(guó)Nick博士很快公布了組裝結(jié)果，經(jīng)過(guò)大量的分析，獲得了大量的基因組轉(zhuǎn)移、致病相關(guān)基因和耐藥與抗性基因等情況。在這個(gè)過(guò)程中就發(fā)展了一種應(yīng)對(duì)突發(fā)疫情的新機(jī)制，即開(kāi)源基因組學(xué)。過(guò)去的做法是，一個(gè)或幾個(gè)研究小組拿到標(biāo)本以后，將其作為一種重要資源，不會(huì)很輕易讓人來(lái)分享，只有文章發(fā)表后才會(huì)公布序列與國(guó)內(nèi)外同行分享；我們做的機(jī)制是拿到基因組原始數(shù)據(jù)后實(shí)時(shí)公布到網(wǎng)上，我們自己還沒(méi)有分析，就供全球科學(xué)家下載分享。截至2011年6月底，序列被下載近15000次，也獲得了各個(gè)國(guó)家專(zhuān)家的分析報(bào)告60多份，我們?cè)倬C合全球的分析，獲得結(jié)論。通過(guò)這個(gè)合作，我們把有突出貢獻(xiàn)的人列為共同第一，參與實(shí)驗(yàn)室的課題負(fù)責(zé)人一起作為共同通訊作者共同發(fā)表。在這些作者當(dāng)中，大部分人都沒(méi)有見(jiàn)過(guò)面，只用兩個(gè)月的時(shí)間把數(shù)據(jù)公布發(fā)表。同時(shí)，因?yàn)橛写罅康娜藛T參加，我們又篩選了一些貢獻(xiàn)比較大的人員列到附件里面，作為工作小組成員，承認(rèn)他們對(duì)大腸桿菌的測(cè)序工作的貢獻(xiàn)。

2012年在英國(guó)出現(xiàn)的類(lèi)似SARS的病毒，迫于輿論和各國(guó)的壓力，英國(guó)僅公布了部分結(jié)果，沒(méi)有把全部結(jié)果無(wú)條件地放到網(wǎng)上讓全球科學(xué)家共享。如果實(shí)施開(kāi)源基因組學(xué)共享機(jī)制，全球科學(xué)家都知道序列，就會(huì)很快建立應(yīng)對(duì)措施。所以，也希望全球科學(xué)家繼續(xù)達(dá)成共識(shí)，將這個(gè)新機(jī)制發(fā)揚(yáng)光大。

再舉一個(gè)例子，2010年海地地震以后發(fā)生的霍亂。截至2011年1月造成17萬(wàn)人感染，3000多人死亡。有一個(gè)說(shuō)法說(shuō)霍亂是由美國(guó)部隊(duì)的救援人員從尼泊爾到海地救援的時(shí)候把細(xì)菌帶來(lái)的，但是一直沒(méi)有100%的證據(jù)，都是新聞媒體報(bào)道。美國(guó)一個(gè)研究小組收集了尼泊爾的菌株和海地暴發(fā)的菌株，通過(guò)全基因組序列鑒定，可以清晰地看到，尼泊爾的和海地的差異非常小，只有一兩個(gè)SNPs差異。該工作100%給出了證據(jù)，即海地霍亂暴發(fā)菌株的確來(lái)自尼泊爾，至于是不是美軍帶過(guò)去的，還需要其他的證據(jù)，要考慮是不是從美國(guó)的士兵拿到這個(gè)病原進(jìn)行分析，就是100%的證據(jù)。英國(guó)SANGER測(cè)序中心把第七次霍亂大暴發(fā)菌株進(jìn)行了測(cè)序，分析了耐藥情況和一些毒力基因的情況等，通過(guò)遺傳發(fā)育分析可以清楚地看到三個(gè)階段：第一個(gè)階段60年代之前，在使用這兩個(gè)抗生素之前，細(xì)菌沒(méi)有耐藥性，使用之后，耐藥性現(xiàn)在逐漸達(dá)到了100 %，霍亂菌株都攜帶這兩個(gè)抗生素的耐藥基因，同時(shí)勾勒了第七次霍亂大流行全球的傳播路線。

再舉一個(gè)例子，美國(guó)一個(gè)實(shí)驗(yàn)室鼠疫的感染，這位老先生60歲了，馬上就退休，但是發(fā)現(xiàn)感染了肺鼠疫，住院后很快就死亡了，但是他在實(shí)驗(yàn)室做的菌株是一個(gè)弱毒，是一個(gè)疫苗株，對(duì)人不致病。但通過(guò)測(cè)序鑒定，他感染的菌株和實(shí)驗(yàn)室的菌株是100%一樣的，也就是說(shuō)這起感染是由實(shí)驗(yàn)室的弱毒株所致的，為什么能感染呢?后來(lái)解剖學(xué)證明，他患有高鐵血癥，我們都知道，細(xì)菌侵人機(jī)體后需要和機(jī)體競(jìng)爭(zhēng)鐵離子才能生存，弱毒株就是缺失了編碼奪鐵能力的基因片段，但該患者患有高鐵血癥，血液中有足夠的自由鐵離子供細(xì)菌生長(zhǎng)，因此，在實(shí)驗(yàn)室操作弱毒株也要注意生物安全問(wèn)題。繼續(xù)講一個(gè)鼠疫的例子，我們和愛(ài)爾蘭、美國(guó)、法國(guó)一些實(shí)驗(yàn)室合作，通過(guò)測(cè)序和 SNPs分析來(lái)追蹤歷史上鼠疫三次大流行的研究。我們分析證明，第三次大流行是從我國(guó)傳出后，通過(guò)商貿(mào)傳播到世界各地。第二次大流行和絲綢之路相關(guān)；文獻(xiàn)也有報(bào)道，炭疽和麻風(fēng)病等的傳播都和絲綢之路相關(guān)。第一次大流行可能和鄭和下西洋的活動(dòng)相關(guān)。

前面幾個(gè)例子說(shuō)明了用全基因組測(cè)序不只可以追溯現(xiàn)在的感染，還可以追溯歷史的感染。通過(guò)全基因組測(cè)序可以給一個(gè)100%的證據(jù)，來(lái)說(shuō)明由某種病是否由某個(gè)病原導(dǎo)致的。例如 600多年前的中世紀(jì)疫情導(dǎo)致了羅馬帝國(guó)的滅亡，但是學(xué)術(shù)界一直有個(gè)疑問(wèn)，就是此次瘟疫是否是鼠疫導(dǎo)致的，有人提出可能是霍亂。一篇發(fā)表在N ature上的文章說(shuō)，將死于那場(chǎng)浩劫的尸體挖出來(lái)，把牙髓里面的鼠疫菌DNA通過(guò)基因芯片都捕獲下來(lái)，然后做全基因組測(cè)序，證明了那次浩劫的確是鼠疫導(dǎo)致的，給出了一個(gè)完美的證據(jù)。

我們實(shí)驗(yàn)室還做了一個(gè)工作，就是把中國(guó)和蒙古國(guó)的鼠疫菌DNA拿來(lái)做全基因組測(cè)序，分析了他們之間的遺傳發(fā)育規(guī)律。同時(shí)也證實(shí)了在傳播暴發(fā)過(guò)程中，菌株的DNA變異累計(jì)加快。據(jù)此，我們提出了一個(gè)假設(shè)，傳染病在暴發(fā)的過(guò)程中有一個(gè)突變加速的過(guò)程，這給疾病檢測(cè)和疾病防控帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)，但用全基因組測(cè)序的辦法可以很快和準(zhǔn)確地鑒定出這些變異。

通過(guò)比較基因組學(xué)分析，我們利用鼠疫菌的所有變異信息建立了一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，用于菌株的溯源。2009年在青海有一次肺鼠疫的暴發(fā)，經(jīng)過(guò)全基因組序列分析，得出這次暴發(fā)是由一只牧羊犬導(dǎo)致的。過(guò)去一直認(rèn)為狗中抗鼠疫抗體的升高，可以作為一種監(jiān)測(cè)野生動(dòng)物宿主感染鼠疫的指標(biāo)，因?yàn)檎J(rèn)為狗對(duì)鼠疫不敏感。我們的分析首次給出了直接的證據(jù)證明狗同樣可以把鼠疫傳播給人，導(dǎo)致鼠疫的暴發(fā)流行。

對(duì)于溯源工作，我們過(guò)去是通過(guò)分子流行病學(xué)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。但是，在美國(guó)"911”炭疽白色粉末生物恐怖襲擊以后，給溯源提出更高的要求，不只要溯到來(lái)源在哪里，更重要的是要作為直接的證據(jù)把施放者送到法庭上，作為呈堂證供。因此，微生物法醫(yī)學(xué)也就應(yīng)運(yùn)而生，包括微生物學(xué)技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、公共機(jī)關(guān)、法律等不同領(lǐng)域的人員交叉來(lái)發(fā)展這個(gè)學(xué)科，當(dāng)然，發(fā)展這個(gè)新學(xué)科的關(guān)鍵是和法醫(yī)學(xué)必須要有一個(gè)指紋數(shù)據(jù)庫(kù)一樣，要想實(shí)現(xiàn)微生物法醫(yī)學(xué)溯源，我們也需要一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。從目前來(lái)講，DNA的成分是最穩(wěn)定的，分析技術(shù)也是最成熟的，所以目前大家還是致力于建設(shè)各種微生物的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)，除了一些間接的分析方法(如PFGE，MLST和VNTR等)外，全基因組測(cè)序會(huì)給我們帶來(lái)更精確、更準(zhǔn)確的溯源結(jié)果。美國(guó)的炭疽最后溯源到疑犯也是靠基因組測(cè)序，但因?yàn)檫@個(gè)疑犯后來(lái)自殺了，這個(gè)事件的溯源調(diào)查也就畫(huà)上了句號(hào)。

在日本有一個(gè)奧姆真理教，在東京地鐵釋放了沙林，很快警方查到了他們生產(chǎn)沙林的工廠。在最后審問(wèn)的時(shí)候，才得知他們?cè)诠ぷ鞔髽巧习惭b了一個(gè)氣溶膠發(fā)生器，他們發(fā)生過(guò)炭疽芽抱等。后來(lái)工作人員進(jìn)行了調(diào)查，從樓頂和臨近區(qū)域分離到了炭疽芽抱桿菌，用MLVA的方法分析證明，他們使用的菌株就是動(dòng)物疫苗株，再次證明了分子生物學(xué)方法進(jìn)行精確溯源的價(jià)值。

下面再舉一個(gè)例子，美國(guó)一家醫(yī)院ICU病房新生兒耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的調(diào)查。他們對(duì)部分來(lái)自關(guān)鍵部位的分離菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，清楚地展示了這些菌株在醫(yī)院的傳播規(guī)律，為醫(yī)院院內(nèi)傳播的預(yù)防控制措施的實(shí)施提供了很好的科技支撐。該研究還提出了兩個(gè)新概念，即菌株的耐藥基因譜(resistome)和毒力基因譜(toxome，前者就是所有抗性基因構(gòu)成的圖譜；后者就是毒力相關(guān)基因的分布情況。通過(guò)直接測(cè)序，只要獲得這兩個(gè)組就可以直接判定選用哪些抗生素治療，知道毒力情況就可以判定菌株的毒性和如何處置。

下面這個(gè)例子是加拿大社區(qū)的一個(gè)結(jié)核傳播感染的調(diào)查。此次疫情主要是吸毒者中進(jìn)行傳播，他們進(jìn)行了一系列的分析，找到病例之間傳播的關(guān)系和路線，能和所有人員的社會(huì)活動(dòng)關(guān)聯(lián)起來(lái)，也可以和微生物結(jié)果和臨床數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)起來(lái)，這是首次將社會(huì)網(wǎng)絡(luò)與高分辨的基因組測(cè)序結(jié)果結(jié)合，通過(guò)這種復(fù)雜的分析，促進(jìn)了結(jié)核暴發(fā)的溯源調(diào)查。同時(shí)顯示，基因組序列分析可以有力地促進(jìn)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果的完善，并且一個(gè)結(jié)核分枝桿菌的基因型包含有足夠的遺傳多態(tài)性來(lái)勾勒菌株間的精細(xì)關(guān)系，以改進(jìn)流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果。

最近美國(guó)FDA(食品和藥物管理局)公布了一個(gè)計(jì)劃，他們準(zhǔn)備測(cè)序10萬(wàn)株食源性病原菌基因組，測(cè)序的平臺(tái)選的是Illumina的MiSeq，準(zhǔn)備花17億美元用5年的時(shí)間來(lái)完成這個(gè)工作。不久的將來(lái)，針對(duì)食品相關(guān)細(xì)菌病原傳染病的暴發(fā)，就可以用這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行快速和高精度的溯源分析了。當(dāng)然做的都是美國(guó)的菌株，如果能很好地實(shí)現(xiàn)傳染病的國(guó)際溯源，要形成很好的國(guó)際合作。我們國(guó)家也啟動(dòng)了相關(guān)工作，就是整個(gè)細(xì)菌病原的測(cè)序工作，跟美國(guó)的想法類(lèi)似，只是投人太少。這也需要我們通過(guò)專(zhuān)家在不同的場(chǎng)合去繼續(xù)呼吁，如果我們不去做，外國(guó)人做好后，我們按人家的去套用，是可以使用，但是失去了對(duì)人類(lèi)染病溯源做出領(lǐng)銜貢獻(xiàn)的機(jī)會(huì)。

前面講的都是一些針對(duì)具體病原菌株的基因組測(cè)序工作。在像河南新型bunyavirus病毒鑒定過(guò)程中，深圳華大基因研究院和河南疾病預(yù)防控制中心聯(lián)合用Metagenomics直接從人的血清里面就可以鑒定出該病毒的基因序列。

所以，高通量測(cè)序技術(shù)給我們帶來(lái)了前所未有的機(jī)遇，包括新病原的發(fā)現(xiàn)與快速鑒定、新分型技術(shù)的發(fā)展，基因組多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)的建立與精確溯源，還有致病與耐藥基因的揭示，當(dāng)然，還可以用于大量的基礎(chǔ)研究工作。

雖然有機(jī)遇，但我們?nèi)悦媾R著挑戰(zhàn)：在技術(shù)平臺(tái)方面，我們國(guó)家的測(cè)序平臺(tái)非常多，包括深圳的華大基因研究院已經(jīng)成了全世界最大的測(cè)序中心，和一些小的測(cè)序公司以及很多單位的測(cè)序平臺(tái)，如何發(fā)揮這些平臺(tái)在應(yīng)對(duì)新發(fā)突發(fā)傳染病中的作用，這是我們需要考慮的問(wèn)題。所以，在國(guó)家層面上，必須有個(gè)大的測(cè)序中心，時(shí)刻準(zhǔn)備著為這個(gè)事來(lái)服務(wù)，如華大基因研究院，就應(yīng)該給予固定的支持，建立一種測(cè)序技術(shù)應(yīng)對(duì)全球新發(fā)突發(fā)疫情的機(jī)制。我也相信，華大會(huì)感興趣為全球和我國(guó)的公衛(wèi)事業(yè)服務(wù)。

資源共享方面，大家拿到傳染病病原的未知標(biāo)本和資源，一般都當(dāng)做寶貝自己來(lái)研究，這個(gè)進(jìn)程很慢，不會(huì)很快，如果要想快速地了解病原，應(yīng)用全球的智慧共同應(yīng)對(duì)，如何應(yīng)對(duì)?資源共享是我們應(yīng)該值得考慮的問(wèn)題。和這兩個(gè)問(wèn)題聯(lián)結(jié)在一起的，最關(guān)鍵的是合作機(jī)制的建立。對(duì)德國(guó)大腸桿菌研究的就是一個(gè)成功的案例，我們定的一個(gè)原則就是，誰(shuí)提供標(biāo)本誰(shuí)就是第一單位、第一作者，因?yàn)闃?biāo)本最重要，所以給標(biāo)本提供者最大的機(jī)會(huì)，盡管后續(xù)的工作他們可能參與的比較少。隨著工作的進(jìn)展，視對(duì)整個(gè)工作完成的貢獻(xiàn)，大家再商議如何排序署名問(wèn)題。如果這種共享和發(fā)表機(jī)制定下來(lái)，大家很快地就會(huì)達(dá)成共識(shí)。

在數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)方面，如果針對(duì)的是列到生物恐怖病原清單的細(xì)菌，我們需要和國(guó)內(nèi)外同行協(xié)商，用什么技術(shù)平臺(tái)來(lái)建立這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，如何共享。對(duì)于鼠疫菌而言，我們?cè)谂c國(guó)際同行的溝通中了解到，大家非常樂(lè)意合作來(lái)共同建立一個(gè)溯源數(shù)據(jù)庫(kù)。幾位有共識(shí)的科學(xué)家2012年在美國(guó)開(kāi)了一個(gè)會(huì)，2013年將在蘇州再開(kāi)一個(gè)會(huì)，在那個(gè)會(huì)上我們會(huì)定一下怎么利用公共的平臺(tái)，利用全球的資源來(lái)建立好鼠疫菌溯源的數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)多贏共享。從我們國(guó)家的思維方式來(lái)講，大家都愿意在一個(gè)單位把所有的事情都完成，但對(duì)溯源數(shù)據(jù)庫(kù)這個(gè)事業(yè)來(lái)講是不可能的。所以在這種新的大平臺(tái)、新合作機(jī)制的要求下，如何打破部的利益，建立一個(gè)精準(zhǔn)的溯源數(shù)據(jù)庫(kù)是值得我們思考的。如果有一個(gè)共同目標(biāo)，就容易抓住機(jī)遇，為世界傳染病暴發(fā)溯源和鑒定工作做出我們應(yīng)有的貢獻(xiàn)。

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4、扈慶華：食源性疾病的快速診斷和溯源

我主要是向各位專(zhuān)家匯報(bào)我們這幾年開(kāi)展的食源性疾病的快速診斷和溯源技術(shù)研究工作，把研究工作中存在的問(wèn)題提出來(lái)，也希望各位專(zhuān)家能夠給予解答。

食源性疾病是最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球每年發(fā)生40億——60億例食源腹瀉。食源性疾病在我國(guó)主要表現(xiàn)為細(xì)菌性食物中毒，還有感染性腹瀉。食源性疾病在導(dǎo)致人民健康受到威脅的同時(shí)，還造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。如2011年德國(guó)發(fā)生的0104： H4腸出血性大腸桿菌感染暴發(fā)疫情。深圳每年也有食物中毒發(fā)生。

食源性疾病或感染性腹瀉主要是由攝人受病原微生物污染的食品而引起的，而食品安全是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，食品的生產(chǎn)涉及原料生產(chǎn)、加工、零售、流通等環(huán)節(jié)，每個(gè)環(huán)節(jié)都有可能受到病原微生物的污染，這對(duì)我們?cè)谔幹檬吃葱约膊”┌l(fā)疫情時(shí)提出了更高的要求，需要快速準(zhǔn)確地確定病因和進(jìn)行溯源，需要回答2個(gè)問(wèn)題：①是什么。引起食源性疾病暴發(fā)的病原菌是什么?②從哪里來(lái)。傳染的源頭在哪里?

食源性疾病由多種致病病原引起，需建立多種病原體的快速檢測(cè)方法和溯源技術(shù)平臺(tái)。

目前在我國(guó)，引起食源性疾病的常見(jiàn)病原體有七八種，但是在國(guó)外每年暴發(fā)的食源性疾病病原有多種，目前認(rèn)為引起食源性疾病的病原體有40-50種，包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)。

傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，現(xiàn)有的快速檢測(cè)技術(shù)主要包括熒光PCR技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、液相懸浮芯片等。

對(duì)于我們來(lái)說(shuō)，在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)急處置時(shí)需要比較快捷、簡(jiǎn)便的方法，我們認(rèn)為比較好的方法應(yīng)該是操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、快速，特別是能在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用的?，F(xiàn)在PC R方法是不容置疑的，目前比較成熟的是單色的、雙重?zé)晒釶CR方法，不成熟的方法有4重或以上的熒光PCR方法，急需改進(jìn)和優(yōu)化。

因?yàn)?002年的食物中毒暴發(fā)疫情多，現(xiàn)場(chǎng)處置需要一個(gè)快速準(zhǔn)確的結(jié)果，所以我們選擇了中通量檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行快速檢測(cè)方法研究，包括多重?zé)晒釶CR技術(shù)和液相懸浮芯片技術(shù)。我們以探針編碼(改良分子信標(biāo))、探針溶解曲線為核心技術(shù)基礎(chǔ)，開(kāi)展多重?zé)晒釶CR方法研究，檢測(cè)的病原體種類(lèi)有37種細(xì)菌、5種病毒、2種寄生蟲(chóng)。液相懸浮芯片當(dāng)時(shí)在國(guó)外做得比較多，因?yàn)樾酒勘萈CR高，我們也開(kāi)展了液相芯片檢測(cè)多種食源性致病菌的方法研究。我們主要是想做這兩個(gè)平臺(tái)技術(shù)的研究。

多重?zé)晒釶CR是2002年開(kāi)始做的，最低檢出限大概是1-6cfu/mL。熒光PCR方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的比較，靈敏度和特異度均為98%以上，所以熒光PCR方法是可以用于食物中毒等突發(fā)公共衛(wèi)生事件的早期診斷。同時(shí)也用了Kappa檢驗(yàn)驗(yàn)證多重?zé)晒釶C R方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。從2003年開(kāi)始進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，成功地應(yīng)用于深圳地區(qū)100多起食物中毒的快速診斷和腸道傳染病的快速檢測(cè)，如沙門(mén)菌、志賀菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157：H7等。

在多重?zé)晒釶C R研究的基礎(chǔ)上，我們開(kāi)始建立應(yīng)用液相懸浮芯片檢測(cè)多重致病菌的方法，做完發(fā)現(xiàn)其靈敏度并不是很高，大概是104-105 cfu/mL。通過(guò)這幾年的研究，我自己感覺(jué)任何技術(shù)都不可能包打天下，熒光PCR做到一管檢測(cè)10個(gè)靶基因，即10重體系可以再提高檢測(cè)通量需要技術(shù)的改進(jìn)。液相芯片技術(shù)最大的一個(gè)缺點(diǎn)就是磁珠依賴(lài)進(jìn)口，所以我也想趁這個(gè)沙龍建議，我們國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)投了這么多錢(qián)，是否可以嘗試研制我國(guó)的磁珠替代國(guó)外產(chǎn)品，降低檢測(cè)成本。

通過(guò)這幾年研究，我的個(gè)人體會(huì)是：對(duì)于已知病原體的快速篩查，開(kāi)發(fā)系列多重?zé)晒釶C R試劑盒(5-10種病原體/管)，利用網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的優(yōu)勢(shì)，組織多個(gè)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，進(jìn)行推廣使用。同時(shí)在國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室、有條件的省市級(jí)CDC建立液相芯片的技術(shù)平臺(tái)，并進(jìn)行方法的標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于未知病原體的篩查，可采用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)、全基因組測(cè)序等。

關(guān)于溯源技術(shù)，昨天闞副所長(zhǎng)講了很多，我們實(shí)驗(yàn)室主要是在分子分型方法的評(píng)估、標(biāo)準(zhǔn)化和應(yīng)用方面做一些工作。我們要評(píng)估一個(gè)方法必須要找一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法，所以還是重點(diǎn)把PFGE方法建好，并用于暴發(fā)疫情的調(diào)查。同時(shí)我們也優(yōu)化MLVA和采用MLST分析本地菌株與其他各省或國(guó)家菌株的關(guān)系。在成功應(yīng)用PFGE進(jìn)行單點(diǎn)暴發(fā)疫情調(diào)查的基礎(chǔ)上，我們希望建立一個(gè)更靈敏的分子分型監(jiān)測(cè)方法，用于暴發(fā)疫情的早期發(fā)現(xiàn)。我們建立了以醫(yī)院為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，在此基礎(chǔ)上建立PulseNet監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)(即細(xì)菌性傳染病分子分型監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò))，希望把調(diào)查提前，不是出現(xiàn)暴發(fā)再去調(diào)查。建立的分子分型監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)(PulseNet China)主要用于暴發(fā)疫情的追蹤溯源和暴發(fā)疫情的早期發(fā)現(xiàn)。

應(yīng)用PFGE進(jìn)行溯源的成功案例，如2005年腸炎沙門(mén)菌食物中毒的溯源、金黃色葡萄球菌中毒溯源等。這些都是出現(xiàn)單點(diǎn)暴發(fā)開(kāi)展的溯源，這些單點(diǎn)暴發(fā)都必須要拿到菌株，然后才可以確認(rèn)源頭。另外我們開(kāi)展了副溶血弧菌M LVA方法的評(píng)估，因?yàn)榱餍胁W(xué)專(zhuān)家經(jīng)常說(shuō)PFGE方法太慢了，通常從標(biāo)本采集、菌株分離到分子分型，需要2周。我們希望將來(lái)溯源的模式采用以PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)進(jìn)行源頭的確認(rèn)。我們篩選了225株有明確流行病學(xué)背景的副溶血弧菌菌株進(jìn)行MLVA方法評(píng)估，我們認(rèn)為6個(gè)位點(diǎn)就足以進(jìn)行副溶血弧菌的MLVA分析。

深圳的183株副溶血弧菌的M LST分析，共有4個(gè)克隆群，其中CC120是深圳獨(dú)特的克隆群。我們查了一下流行病資料，這個(gè)克隆群與食物中毒暴發(fā)是有關(guān)系的。

其實(shí)我們最想做的就是實(shí)驗(yàn)室早期提示暴發(fā)，當(dāng)出現(xiàn)少數(shù)病例時(shí)展開(kāi)調(diào)查，而不是出現(xiàn)大量病例時(shí)再去做調(diào)查。通過(guò)這個(gè)結(jié)果，可以看到每年病原的構(gòu)成和陽(yáng)性率趨勢(shì)，所以我們希望將來(lái)做病原陽(yáng)性率的基線和優(yōu)勢(shì)分子分型條帶數(shù)的基線。腹瀉檢測(cè)、食物中毒應(yīng)該和食品安全結(jié)合起來(lái)，所以舒所長(zhǎng)講為什么加拿大、美國(guó)的PulseNet做得那么成功，我覺(jué)得是因?yàn)樗麄儼咽吃葱约膊》肿臃中捅O(jiān)測(cè)(PulseNet USA，PulseNet Canada)作為一個(gè)常態(tài)工作，每年投人了大量經(jīng)費(fèi)和人力開(kāi)展此項(xiàng)工作，而不是單純的科研投人，是暴發(fā)疫情早期發(fā)現(xiàn)和源頭追蹤的重要技術(shù)支撐，是食品安全保障的重要工作內(nèi)容。我們想做這個(gè)嘗試，當(dāng)然也不可能完全照搬，所以我們首選副溶血弧菌和沙門(mén)菌，準(zhǔn)備利用5年的PFGE數(shù)據(jù)，設(shè)置移動(dòng)平均線，用于副溶血弧菌和沙門(mén)菌感染的暴發(fā)疫情的早期預(yù)警。

目前關(guān)于溯源存在的問(wèn)題：第一，不同病原體，其細(xì)菌基因組結(jié)構(gòu)是不同的，有些細(xì)菌的分子分型技術(shù)的分辨力不足，如腸炎沙門(mén)菌的PFGE分辨率不夠。第二，何時(shí)啟動(dòng)調(diào)查，如何調(diào)動(dòng)流行病學(xué)專(zhuān)家的積極性，確認(rèn)暴發(fā)和溯源，是目前的瓶頸。因?yàn)閰^(qū)別現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的成簇病例是暴發(fā)還是一個(gè)常態(tài)的基線數(shù)據(jù)，需要流行病學(xué)調(diào)查來(lái)證實(shí)分析結(jié)果，這幾年我們做了一些嘗試：即通過(guò)發(fā)現(xiàn)成簇病例，啟動(dòng)流行病學(xué)調(diào)查確認(rèn)暴發(fā)，但是啟動(dòng)調(diào)查后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)成簇病例之間的相關(guān)性。第三，我國(guó)未建立從農(nóng)場(chǎng)到餐桌的食品安全溯源體系，導(dǎo)致溯源難。如在歐洲，每個(gè)到餐桌的雞蛋都編了號(hào)，從哪個(gè)農(nóng)場(chǎng)出來(lái)的，所以他們溯源就比較容易。當(dāng)然還有我們自己銷(xiāo)售的特色，就是很多食品都是在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、流動(dòng)攤檔購(gòu)買(mǎi)，也增加了溯源的難度。

最后就今天的報(bào)告做一小結(jié)，第一，因?yàn)椴≡w的復(fù)雜多樣性，所以只有結(jié)合培養(yǎng)技術(shù)、PCR、蛋白質(zhì)組學(xué)和測(cè)序技術(shù)等多項(xiàng)技術(shù)，才能應(yīng)對(duì)常見(jiàn)食源性疾病暴發(fā)和新發(fā)傳染病的出現(xiàn)。第二，建議國(guó)家多部門(mén)合作，通過(guò)研發(fā)或引進(jìn)，制系列快速檢測(cè)方法，在全國(guó)選擇10-15家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行多重?zé)晒釶CR方法、液相芯片方法的驗(yàn)證，形成SOP文件，在全國(guó)推廣使用。其實(shí)我國(guó)的資源很多，應(yīng)該在新發(fā)傳染病的發(fā)現(xiàn)方面有所貢獻(xiàn)。第三，不同的溯源技術(shù)解決的科學(xué)問(wèn)題不同，需結(jié)合實(shí)際疫情處置和流行病學(xué)證據(jù)，進(jìn)一步驗(yàn)證溯源技術(shù)的分辨力，形成標(biāo)準(zhǔn)化的方法。標(biāo)準(zhǔn)方法就是要很實(shí)用，只要能把一次暴發(fā)解釋清楚、回答清楚就可以了。每個(gè)技術(shù)都不可能是完美的，各有互補(bǔ)。第四，開(kāi)發(fā)適用于不同層次單位使用的檢測(cè)技術(shù)和溯源技術(shù)，形成不同水平的技術(shù)平臺(tái)，解決不同的傳染病防控問(wèn)題。希望國(guó)家級(jí)的研究機(jī)構(gòu)在開(kāi)發(fā)這些技術(shù)的時(shí)候，還要考慮一些實(shí)用性，有些通量高的技術(shù)在國(guó)家層面進(jìn)行研究，有些技術(shù)要考慮推廣。其實(shí)我們現(xiàn)在很多疾病監(jiān)測(cè)做不起來(lái)，原因是技術(shù)方法不是很好?，F(xiàn)在開(kāi)展的疾病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，最終要覆蓋到醫(yī)院，盡量有一些簡(jiǎn)便、簡(jiǎn)單的方法就可以了，所以這個(gè)需要我們不同的平臺(tái)解決不同的問(wèn)題。

我們和廈門(mén)大學(xué)李慶閣教授合作很多年了，還得到了中國(guó)CDC徐建國(guó)所長(zhǎng)、闞飆副所長(zhǎng)的大力支持。